EFFETTI BIOLOGICI DEL PTA
1) Aumenta la concentrazione di Ca++ nella membrana e nel citoplasma cellulare producendo una “attivazione cellulare”
tratto da Niwa Y. & Komuro T.: The effect of infrared ray emitting platinum electro-magnetic wave fiber on the activities of normal human neutrophil and myelotic leucemia cell ines, and the growth of malignant tumors.
Pubblicato anche negli atti del 2° Congresso Medico Internazionale patrocinato dalla Fondazione Menarini, Ascoli Piceno, Italia, 28 maggio 1990
tratto da Niwa Y. & Komuro T.: The effect of infrared ray emitting platinum electro-magnetic wave fiber on the activities of normal human neutrophil and myelotic leucemia cell ines, and the growth of malignant tumors.
Pubblicato anche negli atti del 2° Congresso Medico Internazionale patrocinato dalla Fondazione Menarini, Ascoli Piceno, Italia, 28 maggio 1990
Aumenta la concentrazione di Ca++ nella membrana cellulare grazie alla stimolazione della fosfolipasi A2 ed alla conseguente attivazione a cascata dell’acido arachidonico. L’agglutinazione di stimolanti o antigeni negli specifici recettori induce l’attivazione della fosfolipasi C, della protein-chinasi e di altri meccanismi in successione, con la conseguente mobilizzazione degli ioni di calcio nel citoplasma che diventano un secondo messaggero originando una attivazione cellulare. In diversi casi la mobilizzazione o aumento della concentrazione del calcio è la chiave dell’attivazione cellulare. La chemiotassi neutrofilica, la generazione di ossigeno, il rilascio dell’istamina cellulare, la blastogenesi linfocitaria ed altri fondamentali processi biologici iniziano in corrispondenza di un aumento del calcio intracellulare.
Riguardo a ciò si è esaminato l’effetto della F.A.PTA a livello del Ca++ intracellulare, nella chemiotassi, nella fagocitosi e nella generazione di ossigeno da parte dei normali neutrofili umani. Inoltre, supponendo che potesse esistere la possibilità che tale effetto potesse attivare alcune cellule cancerogene, lo studio è stato esteso anche all’effetto sulle cellule della leucemia mieloide e sulla crescita di tumori maligni impiantati nei ratti. Di seguito si espone il procedimento di tale studio, cosi come i risultati ottenuti.
- Il Ca++ venne determinato mediante carico di FURA e stimolazione con FMLP o ionomicina rispettivamente e la fluorescenza venne determinata con uno spettrometro di fluorescenza Hitachi F-4000.
- La attività chemiotassica delle cellule leucemiche e dei neutrofili si misurò utilizzando piastre di agarosio modificato (soluzione di agarosio con 2,5 ml. di siero di feto di vitello al 10% posti in un mezzo di RPMI 1640). La distanza percorsa dai dieci neutrofili più rapidi fu misurata con un microproiettore.
- La fagocitosi dei neutrofili e delle cellule LMC si determinò mediante aggiunta di emulsione di olio di paraffina opsonizzata con siero umano (riduttore KRP) con sospensione di neutrofili secondo Bligh & Dyer. Determinandosi in tal modo la densità ottica dello strato di cloroformio nella lunghezza d’onda dei 525 nm.
- La generazione di O2 da parte delle cellule leucemiche o dei neutrofili si determinò mediante la riduzione del citocromo C indotto per O2 tramite stimolazione opsonizzata-zymosan.
- Si misurò l’assorbimento a 550 nm ed i risultati vennero convertiti in moli di citocromo C ridotto impiegando la formula E 550 nm = 2,1 x 104/M/cm.
- Le cellule sarcoma 180 o melanoma B-16 vennero inoculate da ratti con tumore a ratti normali (ddY o C57, ratti neri) nei quali era stata impiantata F.A.PTA. La crescita del tumore nei ratti comuni con o senza impianto di F.A.PTA fu analizzata ogni 3 o 5 giorni. .
Risultati
Tavola 1: Effetto della fibra su Ca2+)i, chemiotassi, fagocitosi e generazione di O2 per cellule normali e cellule leucemiche.
La carica di FURA FMLP nei neutrofili normali non si alterò in modo significativo al contatto con la F.A.PTA. Per contro il Ca++ di carica FURA con addizione di ionomicina e quello inattivo aumentarono in misura apprezzabile già 5 minuti dopo il contatto con la F.A.PTA (0.01<P<0.025) (rispetto al gruppo di controllo) ed in modo significativo o marcato 60 minuti dopo il contatto (0.01<P<0.025 per la ionomicina e P<0.001 per l’inattivo.
La chemiotassi dei neutrofili normali fu largamente intensificata 60 minuti dopo il contatto con il tessuto campione (0.025<P<0.005) e si osservò la tendenza all’aumento già 5 minuti dopo il contatto. La fagocitosi dei neutrofili normali fu potenziata 60 minuti dopo il contatto (0.01<P<0.025)
La generazione di O2 aumentò significativamente 5 minuti dopo il contatto (0.01<P<0.05) e marcatamente 60 minuti dopo il contatto (P<0.01).
Relativamente alle cellule leucemiche:
Le cellule HL60 aumentarono leggermente (a 60 minuti) il Ca++ intracellulare, la capacità fagocitarla e la chemiotassi (0.01<P<0.05), così come la capacità di generare ossigeno (0.01<P<0.025).
Le cellule ML1 e K562 non mostrarono cambiamenti rilevanti nella fagocitosi, chemiotassi e generazione di O2, mentre il Ca++ intracellulare diminuì in modo apprezzabile.
Cellula ML1 - (Ca++)i inattivo e con FMLP (0.025<P<0.05)
(Ca++)i con ionomicina (0.01<P<0.025)
Cellula K562 - (Ca++)i inattivo (P<0.001)
(Ca++)i con FMLP e ionomicina (0.01<P<0.025)
Per quanto attiene gli effetti della F.A.PTA sulla crescita dei tumori maligni impiantati nei ratti i risultati si evidenziano negli schemi seguenti.
Riguardo a ciò si è esaminato l’effetto della F.A.PTA a livello del Ca++ intracellulare, nella chemiotassi, nella fagocitosi e nella generazione di ossigeno da parte dei normali neutrofili umani. Inoltre, supponendo che potesse esistere la possibilità che tale effetto potesse attivare alcune cellule cancerogene, lo studio è stato esteso anche all’effetto sulle cellule della leucemia mieloide e sulla crescita di tumori maligni impiantati nei ratti. Di seguito si espone il procedimento di tale studio, cosi come i risultati ottenuti.
- Materiali utilizzati e metodi
Il materiale esaminato fu un tessuto di F.A.PTA. I neutrofili umani normali si ottennero da 7 volontari sani (quattro maschi tra i 18 ed i 40 anni e tre femmine tra i 21 ed i 42 anni) tramite centrifugazione gradiente di Ficoll-Hypaque.
Le cellule mielotiche esaminate furono HL60 (promielocito), ML1 (mieloblasto) e K562 che si ottenne da cellule di leucemia mieloide cronica in crisi blastica e che ha la caratteristica di essere una cellula pluripotenziale. Per la prova dell’effetto inibitorio sulla crescita dei tumori maligni si utilizzarono cellule di melanoma sarcoma 180 e B-16 tratte da ratti affetti. Le provette che contenevano neutrofili normali o cellule di leucemia mieloide erano rifasciate di (ed in contatto con) F.A.PTA ed ai minuti 5, 30, 60, 90 e 120 della prova si determinarono le concentrazioni di Ca++ intracellulare, chemiotassi, fagocitosi e generazioni di O2 dei neutrofili e delle cellule di leucemia mieloide nel modo seguente:
- Il Ca++ venne determinato mediante carico di FURA e stimolazione con FMLP o ionomicina rispettivamente e la fluorescenza venne determinata con uno spettrometro di fluorescenza Hitachi F-4000.
- La attività chemiotassica delle cellule leucemiche e dei neutrofili si misurò utilizzando piastre di agarosio modificato (soluzione di agarosio con 2,5 ml. di siero di feto di vitello al 10% posti in un mezzo di RPMI 1640). La distanza percorsa dai dieci neutrofili più rapidi fu misurata con un microproiettore.
- La fagocitosi dei neutrofili e delle cellule LMC si determinò mediante aggiunta di emulsione di olio di paraffina opsonizzata con siero umano (riduttore KRP) con sospensione di neutrofili secondo Bligh & Dyer. Determinandosi in tal modo la densità ottica dello strato di cloroformio nella lunghezza d’onda dei 525 nm.
- La generazione di O2 da parte delle cellule leucemiche o dei neutrofili si determinò mediante la riduzione del citocromo C indotto per O2 tramite stimolazione opsonizzata-zymosan.
- Si misurò l’assorbimento a 550 nm ed i risultati vennero convertiti in moli di citocromo C ridotto impiegando la formula E 550 nm = 2,1 x 104/M/cm.
- Le cellule sarcoma 180 o melanoma B-16 vennero inoculate da ratti con tumore a ratti normali (ddY o C57, ratti neri) nei quali era stata impiantata F.A.PTA. La crescita del tumore nei ratti comuni con o senza impianto di F.A.PTA fu analizzata ogni 3 o 5 giorni. .
Risultati
Tavola 1: Effetto della fibra su Ca2+)i, chemiotassi, fagocitosi e generazione di O2 per cellule normali e cellule leucemiche.
La carica di FURA FMLP nei neutrofili normali non si alterò in modo significativo al contatto con la F.A.PTA. Per contro il Ca++ di carica FURA con addizione di ionomicina e quello inattivo aumentarono in misura apprezzabile già 5 minuti dopo il contatto con la F.A.PTA (0.01<P<0.025) (rispetto al gruppo di controllo) ed in modo significativo o marcato 60 minuti dopo il contatto (0.01<P<0.025 per la ionomicina e P<0.001 per l’inattivo.
La chemiotassi dei neutrofili normali fu largamente intensificata 60 minuti dopo il contatto con il tessuto campione (0.025<P<0.005) e si osservò la tendenza all’aumento già 5 minuti dopo il contatto. La fagocitosi dei neutrofili normali fu potenziata 60 minuti dopo il contatto (0.01<P<0.025)
La generazione di O2 aumentò significativamente 5 minuti dopo il contatto (0.01<P<0.05) e marcatamente 60 minuti dopo il contatto (P<0.01).
Relativamente alle cellule leucemiche:
Le cellule HL60 aumentarono leggermente (a 60 minuti) il Ca++ intracellulare, la capacità fagocitarla e la chemiotassi (0.01<P<0.05), così come la capacità di generare ossigeno (0.01<P<0.025).
Le cellule ML1 e K562 non mostrarono cambiamenti rilevanti nella fagocitosi, chemiotassi e generazione di O2, mentre il Ca++ intracellulare diminuì in modo apprezzabile.
Cellula ML1 - (Ca++)i inattivo e con FMLP (0.025<P<0.05)
(Ca++)i con ionomicina (0.01<P<0.025)
Cellula K562 - (Ca++)i inattivo (P<0.001)
(Ca++)i con FMLP e ionomicina (0.01<P<0.025)
Per quanto attiene gli effetti della F.A.PTA sulla crescita dei tumori maligni impiantati nei ratti i risultati si evidenziano negli schemi seguenti.
Il simbolo (o) indica la crescita del sarcoma 180 o del melanoma B-16 inoculati a ratti ddY o ratti neri C57 nei quali non era stata impiantata né la F.A.PTA è il disco di ceramica.
Il simbolo (x) indica la crescita del sarcoma 180 o del melanoma B-16 inoculati a ratti ddY o ratti neri C57 nei quali venne impiantata la F.A.PTA.
Il simbolo (•) indica la crescita del sarcoma 180 o del melanoma B-16 inoculati a ratti ddY o ratti neri C57 nei quali venne impiantata il disco di ceramica.
La linea continua ( ______ ) indica la crescita del sarcoma 180 trapiantato nei ratti ddY e la linea tratteggiata (-------) indica la crescita del melanoma B-16 trapiantato nei ratti neri C57.
Il simbolo (x) indica la crescita del sarcoma 180 o del melanoma B-16 inoculati a ratti ddY o ratti neri C57 nei quali venne impiantata la F.A.PTA.
Il simbolo (•) indica la crescita del sarcoma 180 o del melanoma B-16 inoculati a ratti ddY o ratti neri C57 nei quali venne impiantata il disco di ceramica.
La linea continua ( ______ ) indica la crescita del sarcoma 180 trapiantato nei ratti ddY e la linea tratteggiata (-------) indica la crescita del melanoma B-16 trapiantato nei ratti neri C57.
Discussioni e conclusioni
Questi elementi sembrano avvalorare l’ipotesi di partenza, ovvero che l’IR 4 e 14 µ aumenta la permeabilità dell’acqua nella membrana cellulare tramite la frammentazione dei clusters acquei e da ciò si produce la mobilizzazione del Ca++ con aumento del (Ca++)i; ciò avviene nei neutrofili normali e non nelle cellule cancerose prese in esame. Tali effetti benefici si devono alla ridotta dimensione dei colloidi di platino (40Å) che paiono agire come catalizzatori del RIN.
Questi elementi sembrano avvalorare l’ipotesi di partenza, ovvero che l’IR 4 e 14 µ aumenta la permeabilità dell’acqua nella membrana cellulare tramite la frammentazione dei clusters acquei e da ciò si produce la mobilizzazione del Ca++ con aumento del (Ca++)i; ciò avviene nei neutrofili normali e non nelle cellule cancerose prese in esame. Tali effetti benefici si devono alla ridotta dimensione dei colloidi di platino (40Å) che paiono agire come catalizzatori del RIN.
